地拉罗司(JADENU/DEFERASIROX)组蛋白去甲基化酶JmjC KDMs抑制剂

2020-09-10 作者: 康必行-小喆

      甲基化是组蛋白翻译后修饰的基本类型之一,与基因的表观遗传调控密切相关。甲基化由组蛋白甲基化酶(HMTs)催化生成,而赖氨酸去甲基化酶(lysine demethylases, KDMs)则能够催化去甲基化反应。KDMs根据催化机理可分为两种基本类型,其中一种为JmjC KDM,其特征在于含有JumonjiC结构域。在二价铁和2OG(2-氧化戊二酸)的存在下,JmjC KDMs能够对组蛋白上赖氨酸的三甲基化修饰进行去甲基化,得到二甲基化修饰产物,扮演了“表观遗传eraser”的角色。

  然而,JmjC KDMs的过表达也与一些疾病相关,例如其中一种酶JMJD2A(KDM4A)就被发现在多种恶性肿瘤中有表达上调,包括乳腺癌、前列腺癌和肺癌等。因此,针对JmiC KDMs的抑制剂开发也日渐受到关注。目前,针对JmiC KDMs的抑制剂主要包括金属螯合型和底物竞争型,前者通过螯合催化中心的铁原子来实现抑制,而后者则通过竞争性结合来实现抑制。受到上述启发,本文作者对目前已经临床应用的铁螯合剂类药物(用于治疗血铁含量过高)会对JmjC KDMs能有何种影响产生了兴趣。

  为此,作者对三种临床应用的铁螯合剂药物展开了探究,分别为deferoxamine、deferiprone和deferasirox (地拉罗司)。IC50实验的结果表明,三种化合物均能够有效地对JmjC KDMs产生抑制。作者猜测其抑制作用来自两种可能,一是竞争性地螯合体系中的铁离子,二是直接结合蛋白的活性位点(谓之"bonafide"方式)。为了验证猜测,作者首先进行了电子顺磁共振(EPR)谱图的测定,发现化合物deferasirox直接与蛋白的含铁活性位点结合形成了复合物;通过核磁共振(NMR)的测定,该猜测得到了进一步的证实。为了直接从分子结构的角度研究其结合模式,作者又尝试将JMJD2A蛋白和deferasirox共结晶,但并未取得成功。通过计算机模拟分子对接,作者提出了可能的结合模型,即deferasirox通过两个酚羟基和三氮唑的一个氮原子与活性中心的铁原子螯合,同时化合物也与周围的残基存在着氢键和π-π堆积作用。

  基于该结合模型,作者尝试对地拉罗司进行结构上的修饰,以研究构效关系并提升药学性质。为了增强化合物与活性口袋残基的相互作用,作者设计合成了一系列具有不同苯环取代基的衍生物。活性实验表明这些衍生物的抑制作用与原化合物类似或略优。为了验证铁原子螯合模式的重要性,作者尝试将化合物的螯合基团替换为其他螯合基团或H,结果表明其抑制作用显著减弱。

  同时,作者还研究了deferasirox在细胞水平上的生物效应。作者选取了对KDM抑制敏感的KYSE-150癌细胞系进行细胞增殖实验,发现deferasirox及其衍生物能够强有力地抑制细胞的增殖。随后作者对一系列其他的癌细胞系展开试验,并与已知的JmjC KDM抑制剂JIB-04进行对比,结果表明deferasirox与JIB-04有着类似的作用谱。随后,作者还分别在HEK293T和U2OS细胞系中研究了该化合物在分子生物学水平上的效应。通过免疫印迹和免疫荧光成像的表征,作者发现细胞中的组蛋白三甲基化水平明显升高(图5),印证了化合物对JmjC KDM的抑制作用。

  鉴于JmjC KDMs隶属于2OG加氧酶 (2OG oxygenase)超家族,作者还对deferasirox是否能够抑制其他2OG加氧酶展开了探究,以估测该化合物的副作用。结果表明其对其他的2OG加氧酶(如PHD2)具有一定的抑制作用,这增添了该化合物的生物效应的复杂性。

  总而言之,作者首次报道了地拉罗司(原先作为临床的铁螯合剂药物)能够抑制组蛋白去甲基化酶JmjCKDMs,并通过大量的实验证实了其作用机理是直接结合活性位点而非竞争性争夺铁来实现抑制。通过分子对接模拟,作者提出了可能的结合模型,并据此对该分子进行修饰改造,以提升其药学性质。此外,作者还发现deferasirox的抑制对象能够拓展到更广的蛋白家族——2OG加氧酶。该工作为JmjC KDMs等2OG加氧酶的抑制剂的开发提供了新的思路,同时也让人们意识到deferasirox长期以来被忽视的复杂生物学效应。除了作为药物先导化合物,deferasirox同时也有潜力成为组蛋白翻译后修饰研究的化学生物学工具。如患者需要,请咨询康必行海外医疗医学顾问:4006-130-650.

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